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jueves, 29 de septiembre de 2011

El libro rojo, Especies amenazadas - Ballenas, tres gigantes y una pequeña en peligro

miércoles, 28 de septiembre de 2011

Partes del Microscopio óptico y su función



En esta ocasión vamos a ir conociendo las distintas partes del microscopio óptico así como la función de cada una de ellas

Partes mecánicas.

Lentes Oculares: sirven para hacer la observación y son los por los cuales hay que mirar los objetos, normalmente poseen un aumento de 10X. No deben tocarse con los dedos o limpiarse, para esto el encargado del equipo deberá hacerlo tomando los cuidados necesarios para no rayarlos o mancharlos.



En los microscopios binoculares ( dos oculares ) hay un mecanismo que permite separarlos para ajustarlos a la separación de los ojos de cada usuario.

Para observar por los lentes oculares se deberá tener ambos ojos abiertos, aunque el microscopio sea monocular ( un solo ocular ).


El tubo óptico tiene como función soportar los oculares.






El tubo óptico se une a la Caja de Prismas, en la cual hay un prisma quien es el que se encarga de desviar la imagen que se recibe desde el lente objetivo hacia el lente ocular formando un ángulo de 120 grados.

Esta es la razón por la cual no se debe arrastrar o golpear el microscopio a la hora de movilizarlo, pues estos prismas de pueden mover se su posición, la cual es la que permite el enfoque. Obsérvese que el tornillo de la caja de prismas se puede aflojar y con esto se consigue que la misma se pueda girar, con la finalidad de permitir a otras personas observar sin mover el microscopio.



El tornillo se debe aflojar suavemente, nunca hay que girarlo demasiado pues se puede soltar, basta girarlo un cuarto de vuelta.



Siempre es importante que este tornillo quede ajustado cada vez que se mueve la caja de prismas, pues la misma se puede caer. Igualmente, luego de utilizarlo hay que cerciorarse de que el mismo quede ajustado, para evitar que esta parte del microscopio se mueva y se produzca un accidente.


El brazo del microscopio, sirve para transportarlo y soportar algunas piezas como el tornillo macrométrico (para enfoque grueso) y el tornillo micrométrico (para enfoque de precisión).

La platina es una placa metálica con una perforación central sobre ella se coloca la preparación que se va a observar.





Generalmente posee un par de pinzas para sostener la lámina y un sistema mecánico denominado carro. El Carro a veces posee dos escalas que permiten fijar una determinada estructura en la preparación observada, como se ve en la fotografía anterior, esto se logra por medio de la utilización de coordenadas ( como en un mapa ). El Carro, también posee dos Tornillos que se utilizan para mover la preparación de derecha a izquierda y de adelante hacia atrás ( Este, Oeste, Norte, Sur ). ( Tornillos del Carro )




El revólver se encuentra en la parte inferior del tubo óptico y en el se encuentran los lentes objetivos, en los microscopios ópticos puede haber tres o cuatro de estos lentes objetivos. Estos lentes presentan diferente aumento



Lente Bajo Poder: Generalmente 4X
Lente Mediano Poder: Generalmente 10X
Lente Alto Poder: Generalmente 40X
Lente Inmersión en aceite: 100X




El condensador: se encuentra debajo de la platina y su función es la de soportar las lentes que recogen los rayos luminosos.



La base, sirve para darle estabilidad al instrumento. En ella generalmente se encuentran ubicadas la fuente de Luz ( generalmente un sistema de iluminación de 6V con una bombilla halógena o de luz de criptón )

Ajustes del enfoque


Para enfocar la lámina o la preparación existen dos perillas o tornillos, ( Macrométrico y Micrométrico ) las cuales realizan lo mismo básicamente. su función es hacer subir la platina hasta alcanzar la distancia de trabajo o distancia de enfoque, la diferencia es la magnitud en la que ambas funcionan. El macrométricoo se utiliza exclusivamente con la lente de bajo poder, pues mueve en forma apreciable la platina, muientras que el Micrométrico se utiliza en cualquier amplificación.

Partes ópticas.


Lente ocular: Esta se compone de dos lentes. La lente inferior recoge la imagen del objetivo, la reduce y la reforma dentro del ocular a nivel del limitador del campo visual. La lente superior forma una imagen virtual aumentada para ser vista. El aumento de los oculares oscila normalmente entre X5 y X15.


Lente objetivo es el lente mas importante del microscopio la que controla la amplificación posible y la resolución de la imagen. Todos los objetivos se acoplan a los microscopios mediante roscas estándar y pueden ser cambiadas de un microscopio a otro independientemente de su marca.

Los aumentos mas utilizados son: 5X,10X,20X,40X y 100X. Si examinamos un objetivo observamos que hay cifras grabadas por ejemplo: 40X / 0,70:160/ 0,17 en donde: 40X es el aumento del objetivo y 0,70 es la abertura numérica, es decir la medida del tamaño del cono de luz que el objetivo puede admitir, 160 es la longitud en mm del tubo ocular que debe ser utilizado con ese objetivo, 0,17 es el espesor del cubre objeto(en mm) que debe utilizarse con ese objetivo.


El condensador es la lente que ilumina la lente del objetivo, su abertura numérica debe ser suficientemente alta para suministrar el cono de luz requerido.




En la parte inferior del condensador hay una abertura regulable, o diafragma controlado por una palanca lateral.






Hay también un anillo para alojar filtros coloreados o de luz natural.



Técnicas de tinción





Materiales: Diversas muestras de tejido vegetal, microscopio, portaobjetos, cubreobjetos, gotero, lámpara de alcohol, navajillas.




Las estructuras celulares son ( a excepción del cloroplasto ) bastante difíciles de observar a simple vista, esto debido a que aproximadamente el 70 y 90% de la célula es agua. Por esta razón se hace necesario hacerlas visibles, es aquí donde los diferentes tintes que existen son de utilidad. El tipo de tinte a aplicar depende del tipo de estructura que se deseé observar, pero en general los procesos de aplicación del mismo comprende varias etapas:

1. Fijación del tejido
2. Lavado del fijador
3. Aplicación del tinte

En algunos tejidos ( vegetales y fúngicos ) se hace necesario hidrolizar las paredes celulares. A continuación se explica la preparación de algunos tintes y luego cómo aplicarlos al tejido.

Fijadores

La función del fijador es matar al tejido provocando el menor daño posible. Algunos de los fijadores más empleados son los siguientes:

Alcohol etílico: Se consigue puro en concentraciones de 96% m/m, pero este se usa en concentraciones al 70% m/m. Ofrece buenos resultados en la fijación y conservación de organismos enteros o de estructuras anatómicas. En la fijación celular es útil para conservar ciertas enzimas, pero disuelve grasas celulares. El etanol comercial se vende en ocasiones diluido al 70% pero mezclado con tintes, en tales casos antes de emplearlo se debe separar del tinte utilizando carbón activado y agitar, una vez que desaparezca el color se debe filtrar el líquido en algodón. Para efectuar la dilución del 96% al 70% se utiliza en proporción de 3 : 1 en agua destilada.



FAA: ( Formalina, Acido acético, Alcohol ) Es el fijador más empleado y recomendado para los tejidos vegetales y animales, se puede preparar en varias formas, variando la concentración de sus componentes. Debe dejarse actuar por un espacio mínimo de 24 horas.

Formalina comercial ( 36% ) 10 mL
Agua destilada 35 mL
Acido Acético glacial 5 mL
Alcohol etílico 96% 50 mL




Colorantes

Estos se usan para visualizar as diferentes estructuras celulares y subcelulares en ocasiones se pueden combinar para obtener contrastes. Los más empleados son:

Eosina: Se conocen 2 compuestos con este nombre y están relacionados: la eosina Y (tetrabromofluoresceína ), comúnmente conocida como eosina amarilla, y la eosina B (dibromodinitrofluoresceína ), también conocida como eritrosina B azulada. Ambas, en principio, son intercambiables, sin que sean notables las diferencias entre ellas en el resultado de la tinción, por lo que la preferencia de una sobre otra suele seguir un criterio subjetivo. A pesar de ello, la eosina Y es la mas utilizada en procedimientos rutinarios histológicos, como tinción de contraste el la técnica de la Hematoxilina - Eosina. La Eosina es un Colorante amarillento – anaranjado usado comúnmente para contrastar con otros, se puede utilizar en solución acuosa al 1% o alcohólica al 5%.


Tinción histológica con Eosina Y

Eosina acuosa 1%


Eosina 1 g
Agua destilada 99 mL

Eosina alcohólica 5%

Eosina 5 g
Alcohol etílico 96% 95 mL

Safranina O

Es un colorante biológico, de contraste que se utiliza en la Tinción de Gram para proporcionar un color violeta más intenso a las bacterias Gram+ y tiñe de rosa a las bacterias G- ; en histología y en citología. La safranina se usa como líquido de contraste en algunos protocolos de tinción, coloreando el núcleo celular de rojo. Este colorante se utiliza especialmente para técnicas histológicas animales y vegetales.


Diferentes cortes vegetalkes preparados con Safranina O

Preparación: Pese 1 g de Safranina y disuelva en 10 mL de alcohol 50%, agregue 85 mL de agua destilada. En el momento de usar diluya una parte de la solución en 9 partes de agua destilada.

Sudán III o Sudán IV

Usado comúnmente en tejidos vegetales o animales para diferenciar las grasas. Los colorantes para grasas son más solubles en las propias grasas que en el medio en el que van disueltos. Así, al bañar la grasa con la solución del colorante éste tiende a disolverse en la grasa que se va cargando del colorante. Por regla general estos colorantes siempre van en solución alcohólica o bien en una mezcla de alcohol/acetona o alcohol/agua. El Sudán IV produce una coloración progresiva, es decir, que a más tiempo de exposición al colorante mayor es la intensidad de tinción.


Tincion de una placa en un Ateroma con sudan IV

Preparación

Acetona 50 mL
Alcohol etílico 70% 50 mL
Sudán III o IV 0,2 g


Otra forma de preparar el Sudán IV es pesando 1 g de Sudán IV, disuelva en 100 mL de etanol 95%, caliente hasta ebullición. Después agregue 40 mL de glicerina a 60 mL de la solución. Para teñir en cualquiera de los dos casos, corte secciones muy delgadas del material y agregue el colorante deje actuar por 20 minutos y luego caliente suavemente.

Para la fijación previa del tejido el mejor fijador es el formol, que, si bien fija totalmente las grasas neutras, actúa de manera variable sobre le resto de las estructuras lipídicas (colesterol y derivados, fosfolípidos, esfingolípidos...). El formol es aún mejor fijador de grasas si se emplea como formol-cálcico (formol al 10% y cloruro cálcico al 1%). De esta manera los iones de calcio estabilizan los lípidos y el formol los fija más eficazmente.

Orceína

Uno de los tintes más empleados, se utiliza para diferenciar núcleo. Caliente suavemente 45 mL de Acido Acético y agregue 2 g de Orceína, deje enfriar y agregue 55 mL de agua destilada.




Lugol

El lugol o solución de Lugol es una solución de yodo diatómico|I2 (1%) en equilibrio con yoduro de potasio KI (2%) en agua destilada. Fue nombrada en honor al médico francés Jean Guillaume Auguste Lugol.

Este producto se emplea frecuentemente como desinfectante y antiséptico, para cubrir deficiencias de yodo, y para la desinfección de agua en emergencias. En microbiología, es empleado en la tinción de Gram para retener el colorante cristal violeta. Este reactivo reacciona con algunos polisacáridos como los almidones, glucógeno y ciertas dextrinas, formando un complejo de color diferente ( negro, azul, verde ) según las ramificaciones que presente la molécula.

El yoduro de potasio es agregado para aumentar la solubilidad del yodo diatómico por formación del anión triatómico I3-. Además se utiliza como antiséptico y en determinación de algunos polisacáridos, como el almidón o el glucógeno. Frente a la presencia de estos, vira al color negro-morado.




Preparación

Yodo 1 g
Agua destilada 300 mL
Yoduro de potasio 2 g

Se mezclan y se filtran.


Amiloplastos teñidos con lugol

Proceso de tinción

Para aplicar el tinte se procede a sacar el tejido del fijador y ponerlo en agua destilada por lo menos 20 minutos, esto se hace para sacar el fijador del tejido, lo cual, de no hacerse puede interferir en el proceso de tinción. En ocasiones se deben hidrolizar las paredes celulares, para realizar esto una vez lavado el tejido y sacado el fijador se aplica HCl 18% durante tres minutos ( también se puede utilizar Acido Acético 45% ) y se lava de nuevo con agua destilada por lo menos en 6 o 7 ocasiones diferentes. Para realizar los lavados se coloca el tejido sobre un portaobjetos y se agregan 2 o 3 gotas de agua destilada con un gotero, se espera por espacio de 2 o 3 minutos y luego se seca con papel filtro o toalla absorbente, el cual absorberá el agua por capilaridad. Una vez lavado el tejido se aplican 1 o 2 gotas de tinte y se macera el tejido. En ocasiones se utiliza una lámpara de alcohol para calentar suavemente el tejido macerado, no se debe dejar que se seque el tinte . Al calentar suavemente el tinte tiene oportunidad de actuar mejor, en caso de que se seque un poco se puede agregar una gota de agua destilada, una vez teñido el tejido se coloca el cubreobjetos y se observa.

Procedimiento:

Realice diferentes cortes de material vegetal ( longitudinal, transversal y oblicuos ). Aplique a cada muestra una gota de los diferentes tintes. Realice observaciones y dibujos en bajo y mediano poder. Trate de observar el tipo de estructuras y materiales que se logra teñir con cada uno de los tintes.


Descargas

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Recetarios con varios tintes histológicos

Tipos de Microscopios ópticos




01 Microscopios Compuestos: Un microscopio compuesto es un aparato óptico hecho para agrandar objetos, consiste en un número de lentes formando la imagen por lentes o una combinación de lentes posicionados cerca del objeto, proyectándolo hacia los lentes oculares u el ocular. El microscopio compuesto es el tipo de microscopio más utilizado. Un microscopio liviano es un microscopio óptico común utilizando las longitudes de las ondas de luz visibles. Los microscopios livianos son muy utilizados como herramienta para ver objetos pequeños en colores.



El microscopio liviano puede ser binocular o monocular, triocular para el uso de aparatos de video.




Los microscopios ópticos o livianos usan lentes refractivos y oculares hechas de vidrio para dirigir una imagen magnificada hacia el ojo u otro aparato que captura la imagen. La habitual magnificación del microscopio liviano es 1500x pero también puede llegar a 2000x con menos calidad de visión.





02 Microscopio Binocular Estereoscópico. Es otro tipo de microscopio compuesto que posee una lente convergente. El objeto se coloca entre la lente y el foco, de modo que la imagen es virtual y está a una distancia que es la distancia mínima de visón nítida, alrededor de 25 cm. Consta de una base, en la que se sitúa la muestra, y de la que emerge una columna que soporta las lentes y el mando de enfoque. Sólo sirve para exámenes superficiales (disección de animales, observación de colonias, detección de quistes de parásitos ). Se consigue un número de aumentos entre 4 y 60.



03 Microscopio Campo oscuro: Este es una variación del microsopio compuesto pero presenta un fondo oscuro sobre el que se ven los objetos intensamente iluminados.

  • Permite ver el contorno de las bacterias y su movilidad
  • Permite ver los microorganismos sin teñir



Consta de un condensador especial que debe estar muy cercano a la preparación y que lanza sobre la muestra un cono hueco de luz.




Con esto se logra que, solamente los rayos que chocan con las estructuras sometidas a estudio y son reflejados hacia arriba, puedan ser visualizados a través del objetivo.



04 Microscopio Contraste de fases: El microscopio de contraste de fases permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas. Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido de forma que sean visibles las distintas partes de una muestra.



Se puede utilizar para ver parásitos y bacterias en cortes histológicos, y para objetos transparentes y no coloreados (sediemnto urinario). Consta de un dispositivo, situado dentro o debajo del condensador, que produce diferencias de longitud de onda en los distintos rayos.



05 Microscopio Fluorescencia: la fluorescencia es la propiedad que tienen ciertas sustancias de emitir, cuando son iluminadas por una radiación de L corta, otra radiación de L más larga.


Consta de una fuente de luz muy potente y un filtro de excitación que sólo deja pasar la radiación UV deseada. Ésta, tras interaccionar con la muestra, es de nuevo filtrada, dejando pasar solamente la luz fluorescente hacia los oculares. La principal aplicación es en inmunofluorescencia, es decir, reacciones de antígenos con anticuerpos. El microscopio de luz ultravioleta utiliza una L entre 180 – 400 nm



El problema con este tipo de microscopio es que la imagen invisible al ojo humano, hay que utilizar fotografías, fluorescencias o cualquier otra técnica de foto-emisión.

Historia del microscopio




Los griegos y los romanos conocían bien el poder magnificador de los lentes simples que hoy se conocen con el nombre de lupas; pero fue hasta el siglo XII que tales lentes se utilizaron por primera vez para corregir problemas de la vista en personas adultas.



En 1590, los daneses Hans y Zacarías Janssen, combinaron con éxito un lente objetivo convexo con un lente ocular cóncavo, hecho por el cual, se les considera como los inventores del primer microscopio compuesto.


microscopio de Janssen

En 1611, Johannes Kepler (1571-1630) demostró las ventajas de tener tanto el lente del objetivo como del lente ocular convexos, siendo este tipo de microscopio el más común de la época. Entre los años de 1660-1680 el holandés Anton Van Leeuwenhoek (1632-1723) inventó un microscopio constituido por una sola lente y que tenía un poder de amplificación tan grande como los microscopios actuales, sin embargo por orgullo, nunca mostró su invento y los únicos microscopios de ese tipo que existen son los que él construyó.


Anton Van Leeuwenhoek

A pesar de esa actitud Leeuwenhoek fue el primer ser humano que realizó detalladas observaciones y descripciones de la flora microbiana de diversas fuentes como agua estancada, sarro de los dientes, comida en descomposición y otras fuentes de microbios.


microscopio de Leeuwenhoek

Rápidamente sus trabajos asombraron al mundo civilizado y le merecieron un sitio de honor en la Real Academia de las Ciencias de Inglaterra, que en el siglo XVII era el principal organismo científico de Europa.





Contemporáneos a Leeuwenhoek, como Robert Hooke (1635 - 1701) y Cristhian Huygens (1629-1695) continuaron con el perfeccionamiento del microscopio compuesto, implementando más lentes internas y colocando un sistema ocular en la misma plataforma en donde se encuentran los lentes objetivos; sin embargo, la mala calidad de los lentes era un verdadero dolor de cabeza. Tal problema fue superado en parte gracias a los trabajos de óptica de Sir Isaac Newton (1642-1727) que determinan el origen de las imperfecciones de los lentes.



Cristhian Huygens

Tales estudios fueron aprovechados por un físico sueco llamado Samuel Klingenstierna (1698-1765) quien junto con el físico inglés John Dollon (1706-1761) desarrollan el lente acromático logrando así reducir una gran cantidad de imperfecciones en los lentes.


Samuel Klingenstierna

En el siglo XVIII, el trabajo de Geovanni Battista Amici (1786-1863) en la teoría óptica de los lentes de inmersión, abrió el camino para el desarrollo de este tipo de lentes en microscopios, los cuales fueron perfeccionados por Ernest Abbe (1840-1905) quien culminó con la creación del sistema " objetivo homogéneo de inmersión en aceite".


bjetivo homogéneo de inmersión en aceite


Ernest Abbe

A partir de 1910, los adelantos en el microscopio se concentraron en adaptarlo a diferentes tipos de muestras y a las diferentes técnicas de laboratorio, y es bajo esta premisa que surgen el microscopio de campo oscuro, el de fluorescencia, contraste de fases interferencia, luz ultravioleta y rayos X entre otros.


En 1931 tiene lugar uno de los más espectaculares avances en la microscopía: El alemán Ernest Ruska de la " Technische Hoschcule " de Berlín, logra construir el primer microscopio a base de un haz de electrones, el cual era de baja magnificación.


Ernest Ruska

Para 1934, Ruska había superado al microscopio óptico en poder de resolución, y en 1956 la compañía alemana de electrónica Siemmens, perfeccionan el diseño original y logran un aumento 160 000 veces mayor que el mejor microscopio óptico; este diseño se convertiría en el patrón de referencia para los microscopios electrónicos de hoy en día, que por cierto, logran magnificaciones de más de 350 000 aumentos.

Este es un microscopio compuesto con dos lentes oculares como el que se utiliza en la mayoría de los cursos básicos de Ciencias y Biología




Historia del Microscopio ( gracias al amigo
alberto14661 de Youtube )